【北京细胞克隆形成细胞周期细胞凋亡检测实验外包服务】

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细胞克隆形成实验服务流程

6. 结果统计分析。

细胞克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法。所谓克隆是指单个细胞在体外持续增殖6代以上其后所形成的细胞群，形成肉眼可见的克隆。通过计数得出克隆形成率，可对受检细胞的增殖潜力作定量分析。

细胞克隆形成实验缺点：操作繁琐。优点：精确、可靠。

细胞克隆形成实验应用：常用于抗肿瘤药物敏感性测定、基因治疗、肿瘤放射生物学等方面的研究。

细胞克隆形成实验方法：平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。

细胞克隆形成实验计算公式：

克隆形成率比=克隆形成数/接种细胞数

细胞克隆形成实验克隆形成率

细胞接种存活率：只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

克隆形成率：反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同， 细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

平板克隆形成实验

平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞（细胞生长快慢均可）。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度，所以细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大

001 操作步骤

• 取对数生长期的单层培养细胞， 用0.25% 胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞， 把细胞悬浮在 10% 胎牛血清的培养液中备用。

• 将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力 )接种于培养皿中。一般分每皿 50、100、 200 个细胞的梯度密度分别接种含 10mL 37 ℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置 37℃5% CO2 及饱和湿度的环境下，静置培养 2～3 周。

• 经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用 PBS 小心浸洗 2 次。加纯甲醇或【1:3的 醋酸 /甲醇 】5mL，固定 15 分钟。然后去固定液，加适量 Giemsa 应用染色液染 10～30 分钟， 然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

• 将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片， 用肉眼直接计数克隆，或在显微镜 (低倍镜 )计数大于 10 个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

002 注意事项

• 要根据细胞增殖能力设计梯度。一般每孔按50、100、200个细胞的梯度密度设计。

• 终止培养时间以不少于2周而且克隆之间不发生融合为标准。

• 试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

03 软琼脂培养克隆形成试验

原理：让细胞处于不贴壁以及单细胞状态，模拟体内细胞处于半固液的情况，在此情况下检测细胞的增殖能力。单细胞处于软琼脂中，就如同胰酶消化后的状态，此后，细胞继续增殖分裂，形成单克隆。适用于悬浮生长的细胞以及繁殖较快的贴壁细胞。

001 操作步骤

• 用蒸馏水分别制备出 1.2% 和 0.7% 两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后置于55℃的水浴锅中，目的是为了使其保持融化状态。

• 配制含20%FBS、2X双抗的2X1640培养基，用0.22微米的滤器过滤除菌。

• 铺下层胶：1.2%的琼脂糖胶与 2x 培养基 (含有 2×抗生素和 20% 的小牛血清 )1：1混合，加入到6孔板中，每孔1.5mL，室温等其凝固。

• 细胞计数：将细胞用PBS的洗一遍，用胰酶消化，终止后离心，加入新的培养基混匀稀释，调整细胞浓度为5X10⁴/mL。

• 铺上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2x培养基1：1混合，加入100uL的细胞悬液，即5000个细胞，混合均匀后，每孔加入1.5mL。

• 放入37℃，5%CO2，培养箱培养，隔三天后补加培养基，约3周后收细胞。

• 计数比较对照组与实验组的细胞数量，最后进行分析，计算单克隆形成率。

002 注意事项

• 琼脂法所用琼脂应为低熔点琼脂。配好的琼脂要放在水中预温，下层琼脂水温在50-60℃之间，上层琼脂水温不要超过42℃；

• 应使下层琼脂充分凝固后，再浇上层琼脂，以避免上层琼脂培养基中的细胞进入下层琼脂中；

• 浇上层琼脂时操作要迅速，以免液体过凉导致上下分离；

• 操作中不能产生气泡。

结语

由于细胞克隆形成实验难获得真正单细胞悬液，有些肿瘤细胞集落形成率低，确定集落有一定难度耗时长，重复性差，所以祝大家实验顺利！