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阿尔茨海默症大小鼠海马脑立体定位注射AAV病毒行为学水迷宫实验外包服务（Water Maze）是目前阿尔茨海默病（Alzheimer Disease, AD）研究中使用得最多的行为学实验方法，主要用于检测啮齿类动物的空间记忆能力。该方法是由理查德-莫里斯（Richard Morris）于1981年发明，并在三年后对其实验流程进行了进一步的完善，为了表示对发明者的纪念和尊重，人们把这种实验叫做“莫里斯水迷宫（Morris Water Maze，WMW）”。

从80年代初被发明之后，水迷宫逐渐成为AD认知记忆实验中的“主力”。当我们同时以阿尔茨海默症和行为学实验名称进行搜索时，水迷宫的检索所得项目要远多于其他任何行为学实验（图1A）。而且水迷宫对AD行为学研究的统治地位是与日俱增的，在1995年之前，水迷宫实验占列入统计的7种行为学文献总数的44%（图1B），但是到了2020年，这一比例已经增长到了54%（图1C）。由此可见AD研究中水迷宫所处的“统治地位”。

图1. 水迷宫实验是AD研究中最重要的行为学实验

但是和许多动物行为学实验一样，不同的论文中该实验无论是在器材规格，实验流程以及数据统计方面都有很大的差异，往往令人疑惑不解，搞不清楚水迷宫实验到底有没有统一的标准，哪些参数是可以更改的，哪些参数是需要慎重考虑的。为了解答这些疑惑，我们计划从设备、主要流程和统计分析三个篇章来对水迷宫进行解析，希望能让大家对水迷宫实验有一个大致的了解，对影响水迷宫实验的各种因素做到心中有数。需要注意的是，为了叙述方便，这里我们所采用的流程和实验器材规格都是针对小鼠的，虽然大鼠实验中参数会有一定的变化，但是原理是一样的。今天我们从设备即器材的选择开始讲。

水池（Tank）

水迷宫实验的主体是一个圆形的水池，水池的内径一般为120-130cm之间。虽然也有研究采用的是直径100cm或者180cm规格的水池，但水池过大会造成小鼠需要探索的面积增大，学习时间过长，并且小鼠的娇小体型不利于热量的保存，在水中焦躁地游泳进一步加剧了热量的消耗，过长的游泳时间不利于小鼠身心健康，甚至危及生命；另一方面，过大的水池也会造成操作困难，尤其是在引导水池中未完成任务的小鼠走上平台的过程中，小鼠如果位于水池中间，就是考验实验人员手臂长度的时候了。反过来，水池过小会导致实验难度过低，有可能不能对神经系统损伤的小鼠和正常小鼠进行有效区分，可以理解为考题太容易，学习成绩差的学生和优等生都能做出来。

水池一般为50-60cm高，其中水深30cm，留出20-30cm的边缘可以用来放置提示方位用的标志物（Cue）。边缘不宜过低，因为低于10cm的话小鼠在游泳过程中可能会跳出水池，另一方面也没有足够的空间贴标志物。水池一般会由支架支撑起来，高度上方便实验人员进行操作。

图2. 小鼠水迷宫尺寸

如果有条件，水池最好有完整的温控系统，即温度检测和上升降温装置（主要是升温），将水温的波动控制在最低水平。而且这种温控系统的升温设备需要尽量均匀分布，否则水温不均也会影响实验结果。

水迷宫房间内的给排水系统可以大大增加实验的便利性，因此建议设置专门的房间用于水迷宫实验，并能直接安装向水池提供热水的龙头。

如果没有像实验用水浴锅那样有自动温控装置的水池的话，为了实验的连续性，可以用蓄水量更多的水池（即高度超过60cm），更多的水能更长时间地保持水温。不过，仍然需要温度计进行监控，使水温维持在20-22度之间（其实22度是最好的，但是实际上没有自动温控系统的话很难维持，所以在温度低于20度之前要及时加热）。水温过低会导致小鼠体温降低，身体机能下降，严重的可能会导致体弱小鼠死亡，从而影响实验结果；不过如果水温高到一定程度后，小鼠可能会因为体感温度舒适而导致寻找平台的动力减弱，也不利于实验。

为了方便动物行为采集系统的工作以及防止小鼠看到水下的逃生平台，一般针对白色的小鼠，水池材质是深色即可，不需要在水中添加颜料；而白色的钛白粉则可以用于黑色或者灰色小鼠的行为实验。值得一提的是，有研究表明水的颜色对小鼠寻找平台没有影响，这可能是小鼠游泳时抬头运动或者光线折射的缘故。但保险起见，进行深色动物实验的同时也加入白色颜料，主要是为了增加对比度，提高视频分析系统的准确性。

平台（Platform）

逃生平台一般为直径7-10厘米的圆形（虽然方形平台也常有报道，但本人更推荐圆形这种没有尖锐突出的平台），材料上没有特别的要求，能让小鼠站住不要太滑就行。

一般我们是靠调节水位来控制平台是否可见的，但通常如果平台的高度可调的话，对于训练期增加可见平台实验的方案而言会省力很多。如果是专业的水迷宫设备，一般会在水池底部设置定点卡位，这样每次就能将平台放在固定的地方了。另外还有可以遥控平台高度的设备，更加方便实验者使用。

此外，平台的放置位置也是有讲究的，不能太靠水池边缘，因为这样小鼠可能学会的是绕圈求生；也不能放得太靠水池中心，这样小鼠也不需要记住方位，只需要在水池中心很小的范围搜索一下就行了。如果非要选定一个方位，那么平台圆心的位置设定在2/3半径和1/2之间（即图3中的红色圆形和绿色圆形之间的环状地带）。

图3. 平台摆放位置（120cm直径水池为例）

这里需要注意的是，平台的直径增大，会造成迷宫的难度降低，反之则难度增加，个人推荐根据预实验的天花板效应或者地板效应确定，个人总结的标准比例是水池直径与平台直径之比大概是12.65左右，即水池的面积是平台面积的160倍。结合120cm直径水池的规格，平台应设置为9.5cm直径。

此外，关于平台的放置还有以下值得注意的地方，那就是如果是在隐藏平台期，则平台顶部与水面的距离不应该超过1cm，因为如果平台与水面的距离过大，小鼠还是有大半身躯浸泡在水中，因此可能会离开平台去寻找更干燥的环境，不利于对平台的记忆；另外如果是在可见平台期，平台可以放在水面以上1cm左右，太低了可能不利于小鼠观察，太高则小鼠爬上平台会变得困难，如果希望能加快训练速度，还可以在平台上放上小旗子便于小鼠观察；检测期如果是进行多次的话，需要让小鼠在每个trail的最后能够抵达平台，但又不能小鼠还在水中游泳，实验人员当面就把平台放进去，所以只有自动化的水迷宫系统可以实现。

标志物（Cue）

标志物是动物进行空间定位的关键，所以相互之间的区分尤为重要。这些标志物可以放置在迷宫之外，也可以在迷宫之内，目的是让小鼠游泳时能看到。水迷宫内部的标志物一般直径15cm左右，而外部标志物则没有大小的限制。标志物的数量一般在三个或者三个以上，相互之间形状区分要显著。

此外标志物在水池内部只需要10cm直径或者边长即可，而在外围的话则需要相应增大。此外小鼠对颜色并不敏感，对比强烈的形状，小鼠的区分能力更好，PS4手柄右侧的○□△×就是很好区分的形状，增加实心和空心的区别能大大增加小鼠对这些形状的辨识度。

这些标志物的方位与象限对应起来，一般情况下我会以东南西北四个方位的简称（E, S, W, N）对四个方位进行命名，标志物也挂在或者贴在方向相应的位置，从此不再变动（当然有的实验设计非常严谨，会通过改变Cue的方位来确定动物是利用它们来定位的，而非其他如气味等方法），不过这里的名称仅仅是用于区分而已，并不需要与真实的方向相对应。

图4 标志物的放置方式[1-4]

视频采集系统和行为学分析系统

视频采集系统的搭建需要根据具体的实验环境设置，需要注意的主要是反光和边缘畸变。反光的问题可以通过增加光源或者调整摄像头角度实现，边缘畸变则需要扩大拍摄范围，尽量使迷宫不处于边缘。

好了，关于水迷宫的设备就介绍到这里，下篇文章我们将介绍水迷宫最典型的流程。

部分参考文献及图片来源：

[1]https://nathanshock.barshop.uthscsa.edu/integrated-physiology-aging-core/brainhealth/

[2]https://physiologicalresearch.weebly.com/water-maze-test.html

[3]https://www.sciencedirect.com/topics/immunology-and-microbiology/spatial-memory

[4]https://neuropheno.douglas.mcgill.ca/room-equipment-reservation