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APP/PS1小鼠双转基因与APP/PS1/Tau小鼠三转基因阿尔茨海默病模型小鼠的比较研究

方法：采用12月龄雌性2xTg与同龄3xTg,分别进行6E10Aβ单克隆抗体免疫组化染色,以显示Ap阳性神经元及Ap斑,观察其分布与形态等的差异,图像分析系统定量比较其量的变化。

结果：在海马、大脑新皮层及杏仁核区,2xTg组Ap阳性产物位于细胞外成为细胞外Aβ(eAβ),形成大量的Ap阳性斑,Ap阳性神经元少；而3xTg Aβ阳性产物主要位于神经元细胞内,成为细胞内Aβ(iAβ),但Ap阳性斑少见。

结论：2xTg与3xTg Aβ阳性产物分布的差异可能反映了两种AD模型小鼠神经病理等改变的不同。

３ｘＴｇ-ＡＤ小鼠 ２００３年，Ｏｄｄｏ等Ｈ１通过将ＡＰＰｓ。和ｔａｕＰ３０ｌＬ同 时显微注射进ＰｓｌＭ。，基因敲人小鼠的单细胞胚胎 中，得到了携带ＡＰＰｓ，ｔａｕＰ３０ｌＬ，ＰＳｌＭ。４６，基因的三重 转基因小鼠一３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠。相比其它ＡＤ小鼠模 型，这种小鼠具有诸多优点：利于阐明ＡＢ、神经纤维 缠结以及突触功能紊乱三者之间的关系，并且适用 于研究同时针对两种病理变化的ＡＤ疗法；作为纯 合子小鼠能得到基因型明确的后代，不需要大量的 分析，且杂合子同样发生神经病理改变（较纯合子 晚），基因表现型的外显率为１００％，雌雄均同等表 达；相较于两种转基因小鼠杂交所得含有三种转入 基因的动物模型，它具有单一的基因背景，避免了 生物学差异。

３ｘＴｇ．ＡＤ小鼠的神经病理学发生的区域．时程模式十分近似地模拟了ＡＤ，相关变化随时程发展 情况：３～４月龄时在新皮质出现胞内Ａｐ免疫反应；４月龄开始出现水迷宫测试中的长期记 忆功能障碍而学习功能未受损”１；６月龄时在海马 ＣＡｌ锥体神经元出现胞内ＡＢ免疫反应，在额叶皮 质出现胞外ＡＢ沉积（主要在４—５层），并在此时出 现兴奋性突触后电位降低，提示基底神经元传导功 能损伤，长时程增强（ＬＴＰ）和双脉冲易化（ＰＰＦ）损 伤，表明短期记忆功能受损；氧化应激出现在ＡＢ斑 块和神经纤维缠结之前，６月龄时过氧化氢产物明 显高于非转基因小鼠，氧化应激水平显著增高，９月 龄时线粒体氧化磷酸化的关键酶ｃＯｘ和ＰＤＨ均表 现出活性明显降低，且１２月龄时线粒体呼吸效率显 著降低’“；１２月龄时在其他皮质和海马区出现明 显的胞外ＡＢ沉积呻１，此时ｔａｕ蛋白在ＣＡｌ锥体神 经元中出现明显增多并随后出现在皮质神经元，１２ 月龄时出现ｔａｕ蛋白的构象变化一１；１５月龄时在后 皮质区（枕叶、顶叶）出现明显ＡＢ沉积，且ｔａｕ蛋白 出现高度磷酸化和构象改变，并开始出现ＰＨＦ；在 １８月龄时出现明显的ＰＨＦ，神经突周围球状结构明 显Ｈ１。昼夜节律异常在ＡＤ病理变化前发生，并持 续至病理变化发生后，白天活动增加夜晚减少，视 交叉上核中含肠血管活性多肽和含后叶加压素的 细胞数显著降低，提示视交叉上核神经元昼夜节律 紊乱‘１０１。 ３ｘＴｇ．ＡＤ小鼠是目前最接近家族型阿尔茨海默 病的动物模型，它具有ＡＤ的主要神经病理学特 征一ＳＰ和ＮＦＴ，脑中出现神经元死亡、突触丢失等 ＡＤ的重要病理变化，且该转基因动物模型由于认 知障碍出现、病理发生较早，使得研究过程更加经 济快速。随着该模型的研究报道日益增多，更多的 研究人员将了解并选择这种动物模型。 ３ｘＴｇ－ＡＤ小鼠随时程发生的病理变化Ｔａｂ．１ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ３ｘＴｇ—ＡＤｍｉｃｅ 万方数据 中国比较医学杂志２０１５年２月第２５卷第２期 ｃｈｉｎ Ｊｃｏｍｐ Ｍｅｄ，Ｆｅｂｎｌａｒｙ ２０１５，Ｖ０１．２５．Ｎｏ．２ ６３ ２３ｘＴｇ－ＡＤ小鼠相关抗ＡＤ药物研究 ２．１抗ＡＢ的药物 Ａｐ是由ｐ淀粉样前体蛋白（ＡＰＰ）经过水解产 生的３９—４３个氨基酸的羧基端肽段。大部分ＡＰＰ 经仅－分泌酶切割，产生可溶性无毒片段，除此之外 ＡＰＰ仍可受Ｂ一和＾ｙ－分泌酶切割产生Ａｐ。、 Ａｐ。州。ＡＢ。埘疏水性强易聚集，这种不可溶的ＡＢ 片段是形成老年斑的的核心成分。以ＡＢ为靶点的 药物在ＡＰＰ的加工、聚集、清除三方面产生作用。 ３ｘＴｇ－ＡＤ小鼠通过转入ＡＰＰ‰基因能够表现出完整 的ＡＢ病理特征，适用于以此为作用途径的药物 研究。 ．２．１．１ 作用于ＡＰＰ加工途径的药物：目前大多数 药物研究倾向于通过影响ＡＰＰ加工途径来抑制ＡＢ 生成，利用３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠进行这方面的药物研究也 较多。Ｇｒｅｅｎ等ｕ利用３ｘＴｇ．ＡＤ小鼠的ＡＰＰ机制 发现了Ａｚａｉｎｄｏｌｉｚｉｎｏｎｅ衍生物ＳＴｌ０１可以在一个新 的位点上诱导ＡＰＰ解聚，产生１７ｋＤａ的羧基端片 段。ＳＴｌｏｌ能提高老年３ｘＴｇ．ＡＤ小鼠记忆功能，诱 导微管蛋白片段出现，体内外试验均能减少脑内ＡＢ 水平。同样的，Ｂａｇｌｉｅｔｔｏ—Ｖａｒｇａｓ等２１通过给予１２月 龄的３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠糖皮质激素受体拮抗剂米非司 酮，发现也能通过诱导淀粉样前体蛋白（ＡＰＰ）解聚 为一种新的１７ｋＤａ的片段从而显著降低了３ｘＴｇ．ＡＤ 小鼠脑内ＡＢ水平，并通过新背景／地点／物体测试 以及ＭｏＨｉｓ水迷宫实验证实能够缓解病理变化诱导 的认知与记忆障碍。 利用该小鼠模型能够表达多种ＡＰＰ水解酶的 特点，有多种研究利用该模型探讨药物对各种水解 酶的作用。通过给予选择性５一氧合酶激活蛋白抑 制剂ＭＫ５９１可以通过调节１一分泌酶减少ＡＢ，具体 表现为稳定态的四种＾ｙ一分泌酶复合体（Ｐｓ－１，ＮｃＴ， Ｐｅｎ－２和ＡＰＨ一１）水平降低，最终降低脑内ＡＢ。圳、 ＡＢ，埘水平和ＡＢ沉积，改善认知缺陷、记忆 障碍‘１３１。 有报道显示Ｍ１型乙酰胆碱受体的激活能够诱 导仅一分泌酶水解产物４｜，因此，ｃａｃｃａｍｏ等纠选用 能够表现明显的ＡＰＰ水解途径的３ｘ瞻．ＡＤ小鼠，并 给予毒草碱选择性Ｍｌ受体激动剂ＡＦ２６７Ｂ，探讨该 药的药理学机制。发现ＡＦ２６７Ｂ可以增加ＥＲＫｌ／２ 和ＰＫｃ活性，选择性激活ＡＤＡＭｌ７，降低Ｂ分泌酶 ＢＡＣＥｌ蛋白表达水平，从而调节ＡＰＰ加工途径。 Ｐｅｎｇ等叫同样利用３ｘＴｇ－ＡＤ小鼠该特点来研 究左旋丁苯酞（Ｌ．ＮＢＰ）能否能够通过仪一分泌酶途 径影响ＡＰＰ加工而非生成。并证实了左旋丁苯酞 能够刺激正常水解产物０【ＡＰＰｓ释放增多，增加 ＰＫＣｄ的表达，减弱神经胶质活性（使ＧＦＡＰ和ＣＤ５ 活性降低约３０％）和氧化应激损伤（显著降低ＭＤＡ 水平）。最终增强３ｘ强．ＡＤ小鼠学习能力和长期空 间记忆，降低全脑内ＡＢ水平，减少Ａ￥沉积。 ２．１．２ 抑制ＡＢ聚集的药物：３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠的一大 病理特征即为以ＡＢ聚集为核心的老年斑，因此，众 多学者选择３ｘＴｇ．ＡＤ小鼠作为研究针对ＡＢ聚集药 物的。根据ＡＢ假说，ＡＢ免疫治疗已经成为一种成 功清除脑内ＡＢ从而预防其造成的神经元损伤的治 疗手段１。Ｍａｍｉｋｏｎｙａｎ等副希望通过产生多种 ＡＤ样病变、更加接近ＡＤ的３ｘＴｇ．ＡＤ小鼠来证实向 海马内注射ＡＢ，抗体的被动免疫治疗效果，发现 该抗体抑制Ａｐ。：低聚物生成，抑制ＡＢ。：纤维化，诱 导ＡＢ。：纤维的前体成为非纤维状的无毒物质。 雄性激素缺损能加速ＡＢ聚集，加重行为缺陷， 并且有研究报道３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠脑内类固醇水平随 着年龄的增加有所变化…。Ｒｏｓａｒｉｏ等旧叫希望通过 运用具备多种ＡＤ样病理变化并存在激素增龄性变 化的３ｘＴｇ－ＡＤ小鼠进行探究神经类固醇激素二氢 睾酮（ＤＨＴ）对于ＡＤ的药理作用。发现ＤＨＴ可以 缓解切除性腺的小鼠脑内ＡＢ聚集和行为缺陷。 研究显示选择性５一ＨＴ再摄取抑制剂（ＳＳＲＩｓ） 有望在ＡＤ中提高认知功能、缓解氧化应激Ｂ“。 ｃｈａｄｗｉｃｋ等旧引同样选择了相比较于其他动物模型 更加全面模仿ＡＤ的３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠，研究了三环类 抗抑郁药阿米替林的药理作用，发现它可以增强无 毒ＡＢ单体的同时减少毒性ＡＢ二聚体，明显改善老 化产生的空间学习记忆能力障碍和认知损害。 美金刚是现如今为数不多的被用于临床的抗 ＡＤ药物之一，它是一种ＮＭＤＡ受体拮抗剂，调节谷 氨酸能系统旧“。同样由于３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠更加接近 ＡＤ的病理特征，Ｍａｒｔｉｎｅｚ—ｃｏｒｉａ等１选择该模型探 究美金刚针对ＡＤ病理的治疗效果，发现它可以修 复认知功能，降低不可溶Ａｐ、Ａｐ十二聚体、可溶性 纤维前体低聚物以及纤维低聚物的水平，缓解ＡＢ 诱导的海马ＬＴＰ受损从而预防突触功能紊乱。 由于３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠ＡＢ病理发生、聚集产生较 早，多种药物以此为模型探究药物对于ＡＢ聚集的 影响。体外实验证明多种非甾体抗炎药（如：布洛 芬、酮洛芬、双氯芬酸、阿司匹林）呈剂量依赖性地 抑制ＡＢ纤维，并限制其延伸５｜。ＭｃＫｅｅ等旧叫对１ 和６月龄３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠用非甾体抗炎药布洛芬进行 万方数据 中国比较医学杂志２０１５年２月第２５卷第２期 ｃｈｉｎ Ｊｃｏ“ｐ Ｍｅｄ，Ｆｅｂｎｌａｒｙ ２０１５，Ｖ０１．２５．Ｎｏ．２ 给药，发现海马内ＣＡｌ区域６Ｅ１０、Ｎｕ一１阳性细胞减 少，并能够减少胞内ＡＢ低聚物，缓解认知缺陷。 ２．１．３促进Ａｐ降解的药物：相较于抑制ＡＢ生成、 聚集的药物研究，利用３ｘＴｇ．ＡＤ小鼠研究促进ＡＢ 降解药物则较少，３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠仍旧适用于该类药 物的研究。Ｍｅｄｉｎａ等旧刊发现长期在３ｘＴｇ－ＡＤ饮食 中添加甲基蓝能够提高脑内胰凝乳蛋白酶和胰蛋 白酶水解酶活性，从而增加ＡＢ降解，降低可溶性 ＡＢ水平，提高学习和记忆功能。 ２．２作用于ｔａ的药物 ３ｘＴｇ．ＡＤ由于转入ｔａｕＰ３０１Ｌ基因能够表现出 明显的ｔａｕ病理变化。由于ｔａｕ蛋白的异常过度磷 酸化，使得ｔａｕ蛋白与微管蛋白的结合能力下降，促 进微管组装功能减弱，进而ｔａｕ蛋白从微管上脱落、 相互聚集，形成具有神经毒性的寡聚体，最终形成 双螺旋纤维丝、神经元纤维缠结。因此，以ｔａｕ蛋白 为靶点的研究可以选用３ＸＴｇ．ＡＤ小鼠作为工具来 探索药物的作用，主要分为三个方面：抑制ｔａｕ蛋白 磷酸化；抑制ｔ跏蛋白聚集；促进ｔａｕ蛋白解聚。 ２．２．１ 抑制ｔａｕ蛋白磷酸化的药物：３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠 能够表现出明显的ｔａｕ蛋白磷酸化水平升高，并且 转基因模型小鼠在调控ｔａｕ蛋白磷酸化的各类激酶 方面相较于对照小鼠有明显的病理性变化，如糖原 合成激酶．３（ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｌｌａｓｅ ｋｉｎａｓｅ一３，ＧＳＫ－３）、细 胞周期依赖性蛋白激酶５（ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ． ５，ＣＤＫ－５）等。目前根据这一特征选用该模型进行 ｔａｕ蛋白相关药物研究的例子较多。 利用３ｘＴｇ－ＡＤ小鼠能够激活ＧＳＫ３Ｂ活性产生 ｔａｕ蛋白磷酸化，可以进行以ＧｓＫ３Ｂ为靶点的药物 研究。以３ｘＴｇ－ＡＤ小鼠为模型，Ｇｇ等口副发现黄 酮醇类天然药物桑色素可以降低该小鼠脑内 ＧｓＫ３Ｂ活性，从而降低海马神经元内ｔａｕ蛋白的 Ｓｅｒ３９６、Ｓｅｒｌ９９／２０２位点高度磷酸化。 同样以３ｘＴｇ－ＡＤ小鼠为模型，Ｃａｃｃａｍｏ等’２引发 现金属离子锂可以通过增高ｓｅｒ２１和ｓｅｒ９位点的磷 酸化降低ＧＳＫ－３ｄ和ＧｓＫＯＢ的活性，从而降低ｔａｕ 蛋白Ｔｈｒｌ８１、Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５位点的磷酸化水平。 此外，为了进一步探究美金刚的药理学机制， 利用高度模仿ＡＤ复杂病理的３ｘＴｇ．ＡＤ小鼠，能够 发现其通过提高ＧＳＫ３Ｂ Ｓｅｌ９位点的磷酸化水平，从 而降低总ｔａｕ蛋白水平和ｔａｕ蛋白磷酸化位点２１２／ ２１４、１９９／２０２和２３１的磷酸化水平，并降低总体的 ｔａｕ和过度磷酸化的ｔａｕ的水平’。 ２．２．２抑制ｔａｕ蛋白聚集的药物：３ｘＴｇ－ＡＤ小鼠能 够表现出明显的ｔａｕ蛋白磷酸化、ｔａｕ蛋白聚集，这 为研究抑制ｔａｕ蛋白聚集的药物提供了便利条件。 Ｂａｇｌｉｅｔｔｏ—Ｖａｒｇａｓ等２１发现给予３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠糖皮 质激素受体拮抗剂米非司酮后，该药物除作用于ＡＢ 外，亦能减少ｔａｕ蛋白磷酸化和ｔａｕ蛋白的聚集，伴 随ｐ２５的降低，并且它能够提高３ｘＴｇ－ＡＤ小鼠脑内 与学习能力损伤有关的ＣＲＥＢ和ｐ－ＣＲＥＢ的水平。 ２．２．３ 促进ｔａｕ蛋白解聚：３ｘＴｇ－ＡＤ小鼠脑内ｔａｕ 蛋白聚集显著增加使得采用该模型研究促进ｔａｕ蛋 白解聚成为可能。以此为依据，选择性５一氧合酶激 活蛋白抑制剂ＭＫ５９１能够显著降低３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠 ｔａｕ蛋白ｓｅｒ３９６位点的磷酸化水平，并发现给药后 不可溶ｔａｕ蛋白聚体水平显著降低，其机制可能是 通过降低Ｃｄｋ５激酶水平“。 通过选用此动物模型，Ｇｒｅｅｎ等ｍ１发现水溶性 维生素烟酰胺可以通过修复泛素一蛋白酶体系统，降 低３ｘＴｇ．ＡＤ小鼠特异性ｔａｕ蛋白Ｔｈｒ２３１位点磷酸 化，促进ｔａｕ蛋白解聚，并且能够增加乙酰化的ａ－ ｔｕｂｕｌｉｎ微管蛋白、ＭＡＰ２ｃ，使微管结构稳定。 ２．３其他 ２．３．１作用于线粒体的药物：近年来关于ＡＤ发病 机制大部分研究都支持ＡＢ和ｔａｕ蛋白理论，然而其 它的一些因素同样影响ＡＤ的病程，线粒体功能紊 乱便位列其中。３ｘＴｇ．ＡＤ小鼠在ＡＢ斑块和神经纤 维缠结之前即出现氧化应激水平增加，提示出现线 粒体损伤，因此，该动物模型同样适用于研究以线 粒体为靶点的药物。因此，ＭｃＭａｎｕｓ等Ｈｕ选择了 ３ｘＴｇ．ＡＤ小鼠作为模型，检测了新型线粒体靶向抗 氧化剂ＭｉｔｏＱ抑制脑内ＡＤ样病理变化的效果，结 果显示ＭｉｔｏＱ能够防止认知功能下降，缓解氧化应 激，降低皮质细胞凋亡蛋白酶活性，抑制脑内ＡＢ聚 集、星形胶质细胞聚集、突触丢失，缓解ＡＢ诱导的 神经元毒性并且抑制毒性物质产生和线粒体膜电 位丢失。 ｃｏｒｏｎａ等ｐ２１同样选取３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠通过对其 补充左旋肌肽后，检测出线粒体复合物Ｉ／Ｉｌ／ＩＶ水平 增加，且ＡＤ中与年龄相关的线粒体功能紊乱得到 缓解，最终显著减少海马胞内ＡＢ聚集。 ２．３．２作用于突触的药物：研究证实３ｘＴｇ＿ＡＤ小鼠 能够表现出基底神经元传导损伤，ＬＴＰ／ＰＰＦ受损， 所以可以用于探究作用于突触的药物。通过应用 ３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠作为动物模型，发现美金刚能够减少 细胞体树突积聚，通过调节ＮＭＤＡ受体阻止ＡＢ诱 导的对ＬＴＰ的抑制作用埘。；选择性５－氧合酶激活蛋 白抑制剂ＭＫ５９１可以在３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠产生明显神 经病理学变化之前缓解突触功能紊乱，表现为逆转 万方数据 中国比较医学杂志２０１５年２月第２５卷第２期 ｃｈｉｎ Ｊｃｏ”ｐ Ｍｅｄ，Ｆｅｂｎｌａｒｙ ２０１５，Ｖ０１．２５．Ｎｏ．２ ６５ ＬＴＰ的明显降低…；ＭｉｔｏＱ亦能够拮抗突触素降低， 减少３ｘＴｇ ＡＤ小鼠皮质内突触丢失“；抗抑郁药阿 米替林能够提高３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠海马中突触前／后蛋 白（如ｓｙｎａｐｓｉｎＩ，ＰｓＤ９５）的表达，提示阿米替林能够 缓解突触损伤口…。 ２．３．３抑制神经炎症的药物：神经炎症是ＡＤ的病 理特征之一，由于３ｘＴｇ－ＡＤ小鼠能高度模仿ＡＤ的 病理变化，因此，仍旧有研究者使用该模型以探讨 作用于神经炎症的药物的药理学机制。Ｐａｒａｃｈｉｋｏｖａ 等副研究发现，广谱四环类抗生素米诺环素能够通 过显著降低多种神经炎症因子（如ＴＮＦａ、ＩＬ６等）， 降低不可溶Ａｐ和可溶性ＡＢ小纤维的水平，改善海 马、皮层、杏仁核相关的学习记忆缺陷。

３结论 ３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠模型目前主要被应用于药物的药 效学评价和药理学研究。

作为药效学评价的动物 模型，３ｘＴｇ—ＡＤ小鼠在ＡＢ和ｔａｕ蛋白方面病理表现 完整，适合大部分抗ＡＤ药物研究。此外，针对其它 药物作用靶点的药理学研究（如线粒体、突触损伤、 炎症）该模型也适用。ＡＤ发病机制复杂，多靶点药 物已逐渐成为研究主流，３ｘＴｇ．ＡＤ小鼠能在同一模 型中表现出多种病理变化，是研究多靶点药物理想 的动物模型，将逐渐受到研究者的重视。