蛋白印迹WB（Western Blot）实验外包服务简介:
蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark)。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot。蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
原理:
与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似,但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
Western Blot显色的方法主要有以下几种:
i. 放射自显影
ii. 底物化学发光ECL
iii. 底物荧光ECF
iv. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。
蛋白印迹WB（Western Blot）实验外包服务是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法，用于检测经电泳或斑点杂交后固定于膜上的蛋白质的检测。特异、稳定的液态酶标抗体和相应的底物，保证了快速、准确的检测；而避免了放射性物质的使用，现已成为蛋白分析的一种常规技术，对蛋白进行定性和半定量分析。
北京生物公司 有丰富的蛋白印迹WB（Western Blot）实验外包服务经验，成功完成了各种蛋白的检测，除了传统的流程外，公司也掌握了快速转膜法（一天完成WB），红外二抗检测（Oddssey）等技术。
蛋白印迹WB（Western Blot）实验外包服务操作流程：
1.蛋白质抽提
蛋白印迹WB（Western Blot）实验外包服务实验对象为组织样品，取适量（250~500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
蛋白印迹WB（Western Blot）实验外包服务实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2. 蛋白质定量：按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE):将准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4. 蛋白质转移到PVDF膜,按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，300mA恒流条件下，4°C转移90分钟左右。
5. western blot膜的封闭和抗体孵育。
膜在5％脱脂奶粉(磷酸化蛋白用BSA)溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
封闭过的膜加入一抗4°C孵育过夜，抗原抗体结合。
加入HRP标记的二抗体以结合一抗，室温孵育膜1小时。
6. western blot结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
当加入的二抗选择外红荧光二抗时，用Oddssey曝光条带。
7. western blot数据分析，可定性、半定量分析。
8. 提供实验报告，包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关数据。
蛋白印迹WB（Western Blot）实验外包服务样品要求:
客户需新鲜或正确保存的蛋白样品，目的蛋白阳性表达样品（如果有阳性表达的细胞或组织）， 检测目的蛋白的一抗（建议由科佰生物代购）。
蛋白印迹WB（Western Blot）实验外包服务样品要求为:
·裂解样品总蛋白量＞500ug/样品；
·细胞样品总蛋白浓度＞1mg/ml；
·组织样品总蛋白浓度10-15mg/ml。
蛋白印迹WB（Western Blot）实验外包服务说明:
1. 建议提供目的蛋白阳性表达样品（纯蛋白或有阳性表达的细胞或组织）作为阳性对照 ；
2. 每张膜（小号）可检测1-8个样品，大号膜可检测1-24个样品；
3. 一抗需在正确条件下保存，避免污染及反复冻融；
4. 如需进行数据分析，请另询价。
蛋白印迹WB（Western Blot）实验外包服务提交的产品和资料:
1.曝光结果（胶片和扫描图）；
2.实验报告。
| 蛋白抽提 | 总蛋白 |
|
2-3周 |
| 蛋白抽提 | 核浆蛋白分开 |
|
2-3周 |
| 蛋白定量 | 提供蛋白测定总蛋白浓度 |
|
2-3周 |
| Western Blot预实验 | Western Blot 检测一抗体特异性 |
|
2-3周 |
| Western Blot | Western Blot 标准服务(包括蛋白质提取和定量，Tubulin标定，不含一抗） |
|
2-3周 |
| SDS-PAGE | 客户提供蛋白样品 |
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